增強型 ECL超敏發光液

增強型 ECL超敏發光液產品介紹：

ECL化學發光試劑盒能夠被辣根過氧化物酶（HRP）催化發光。本試劑盒優化了底物組成，使用了新型高效增強劑，發光強度比傳統 ECL顯色液提高了30-100倍，并有效地降低了背景。試劑盒使用新的氧化劑代替不穩定的雙氧水，提高了試劑盒的穩定性，室溫可穩定放置1年。工作液被 HRP 催化后，發出特定波長熒光（400-450 nm），可對X光膠片曝光，也可直接使用熒光CCD掃描，主要應用于Western 檢測以及化學發光免疫檢測系統。

使用說明：

一、緩沖液的配置：

1、一抗工作濃度：0.2-1.0 µg/mL。

2、HRP 標記二抗工作濃度：10-500 ng/mL，根據二抗效價調整。

3、顯色液的使用比例：A液: B液 = 1:1（現用現配）；10 cm2轉印膜使用1-2 mL工作液。

二、增強型 ECL超敏發光液操作步驟：

1、根據常規操作轉印結束后，進行封閉、一抗孵育、二抗孵育以及必要的洗膜步驟，根據膜的大小，按每 250px2膜使用1-2mL工作液，按比例吸取等體積溶液A和溶液B混勻，配制成發光檢測工作液。

2、用平頭鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體。用移液器將工作液加到轉印膜上，使其均勻覆蓋，室溫孵育 1-2 分鐘，此步驟可在潔凈保鮮膜上或塑料盒中完成。

3、X 光膠片法

a)用平頭鑷子夾起轉印膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工作液，不要讓膜全干燥。膜的蛋白面朝上，包裹于潔凈保鮮膜內。輕輕趕出其間的氣泡用小塊透明膠帶粘住四角，固定在 X 光片暗盒內。

b)在暗室中取一張X光膠片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光30秒至1分鐘。立即顯影、定影，根據曝光強度，調整下一張X光膠片的曝光時間。如果背景過高，可以使用兩張X光膠片同時壓片。

4、熒光拍照法：

a)如果需要使用 CCD 拍照，可以將膜放置于工作液中，開機后按照使用說明，將轉印膜取出，進行拍照。

b)可以根據背景情況，調整機器測量參數，提高信噪比。

5、管式化學發光法：

a)將ECL的化學發光檢測波長可設定在 425nm 左右，可以選擇單點測量，或者取多次平均值。

b)按照機器要求，將配制好的工作液加入到樣品管中，間隔一定時間測量發光強度。

c)意ECL系統的發光到達峰值有一定延遲（30-300 秒），不同樣本的測量時間間隔要固定。

d)HRP 催化ECL發光的體系還受到反應溫度以及 pH 的強烈影響，所以工作試劑準備以及發光測量需要考慮到此類因素。

注意事項：

1、試劑盒溶液A為底物，保存于避光試劑瓶中，溶液B為氧化劑。通常取樣順序是先取底物 溶液A，換槍頭后再取氧化劑溶液B。

2、本試劑盒較為穩定，室溫（25℃）可以保存一年以上，長期不用建議保存在 2-8℃。

3、使用生物素-親和素系統時，避免使用牛奶封閉，可能會造成背景過高。

4、金屬氧化物顆粒可能會造成膜上出現顆粒狀斑點，避免使用帶有銹跡的剪刀以及鑷子，可以使用平頭塑料鑷子。

5、sodium azide抑制 HRP 的催化能力，在緩沖液中盡量避免使用sodium azide作為防腐劑。

6、封閉、洗膜、孵育等步驟耗時較長，注意膜與塑料界面的摩擦不均勻可能造成部分位置條帶消失，可以在保鮮膜中孵育以及封閉，洗膜的塑料盒底面不要有明顯凸起，可以通過剪角的方法，區別轉印膜有蛋白的一面。

7、不同轉印膜對蛋白的吸附能力不同，硝酸纖維素較軟，避免出現折痕。PVDF膜使用前需要使用甲醇水化均勻。

8、勿將多張膜置于同一個洗膜盒中洗膜，相互吸附以及摩擦可能造成很深的背景。

9、轉印、封閉、孵育都要避免氣泡。

A and Q

Q：膠片無條帶顯現或者信號較弱。

A1：轉膜的效率低 --用預染色分子量標準來判斷，提高轉膜效率。

A2：抗原/抗體量少或不匹配 --增加抗原/抗體量或選擇合適抗原/抗體。

A3：X光膠片有問題 --X光片洗片以后應當為透明的膠片，如果全黑則說明已經全曝光了，應當廢棄。

A4：定顯影液有問題 --可以先曝光一張膠片來驗證，若有問題及時更換新的定顯影液。

A5：反應系統中HRP量過多 --稀釋HRP標記物。

Q：X光膠片背景臟。

A1：一抗、二抗濃度太高 --降低抗體濃度，延長封閉時間。

A2：抗體未清洗干凈 --增加洗膜次數。

Q：條帶有空斑。

A：抗原以及二抗的濃度過高 --稀釋樣品重新跑膠，也可以將混合好的顯色液冰浴后，加入到膜上，立即快速顯色。

Q：帶型不規則。

A：轉膜時有氣泡也有可能是轉印膜沒有水化均勻 --轉膜時盡量優化條件。